人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

李朝阳¹， 温   南²， 杨中汉²， 蔡卫斌²， 李明友³， 刘祖国¹， 高国全²， 杨   霞²

( 1. 眼科学国家重点实验室//中山大学中山眼科中心， 广东 广州   510060； 2. 中山大学中山医学院生物化学教研室， 广东 广州   510080； 3. 广州市启源生物科技有限公司， 广东 广州   510630 ）

      摘   要：【目的】  提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。 【方法】  调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pH、A₆₀₀值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】  优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为 37 ℃ ，最佳抗生素浓度为50 μg/mL羧苄青霉素，最适pH值为7.0，在A600为0.9 ～ 1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件， 37 ℃ 诱导10 h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21 mg/L，产量较优化前(15 mg/L)提高近30％；mK5特异性地抑制HRCEC的增殖，IC₅₀=40 nmol/L。【结论】  本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数，并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。

      关键词：人纤溶酶原K5；缺失突变体；血管新生；优化表达

      中图分类号：Q784            文献标识码： A            文章编号：1672-3554（2008）02-0221-05